不含染料的 MasterMix 產品在 PCR 結束后需混合適量的上樣緩沖液再上樣電泳， 含染料的 MasterMix 產品在 PCR 結束后可以直接上樣電泳。
不含染料的 MasterMix 產品在 PCR 結束后需混合適量的上樣緩沖液再上樣電泳， 含染料的 MasterMix 產品在 PCR 結束后可以直接上樣電泳。
（注意：以下舉例為常規PCR體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的片段大小 不同進行相應的調整和優化） 1. PCR體系 推薦反應體系（20 μl）試劑用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物濃度請以終濃度 0.1 - 1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引 物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系） 2. PCR 程序過程溫度時間預變性94℃2 min變性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，無法得到理想的擴增效率 時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。b 延伸時間應 根據所擴增片段大小設定，Pfu DNA Polymerase 的擴增效率為1 kb/min。c 可根據擴增產物的下游 應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異 性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環次數） 3. 結果檢測：反應結束后取5 μl反應產物，加入適量上樣緩沖液（含染料的不用加）， 然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
（注意：以下舉例為常規PCR體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的片段大小 不同進行相應的調整和優化） 1. PCR體系 推薦反應體系（20 μl）試劑用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物濃度請以終濃度 0.1 - 1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引 物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系） 2. PCR 程序過程溫度時間預變性94℃2 min變性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，無法得到理想的擴增效率 時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。b 延伸時間應 根據所擴增片段大小設定，Pfu DNA Polymerase 的擴增效率為1 kb/min。c 可根據擴增產物的下游 應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異 性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環次數） 3. 結果檢測：反應結束后取5 μl反應產物，加入適量上樣緩沖液（含染料的不用加）， 然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1. 去除基因組：根據以下表格配制反應體系，總體積為 10μl。為了保證反應液配制的準 確性，先按反應數+2 的量配制預混體系，然后再分裝到每個反應管中，最后加入 RNA。10×gDNA Remover1 μlRNA 模板0.01~1μgDEPC-ddH2O補足至 10μl(注意：如果總 RNA 量大于 1 ug，請按比例擴大反應體系)將反應液輕輕攪拌均勻，短暫離心使管壁上的溶液收集到管底，室溫或 25-37℃溫育 5 分鐘。 2. 反轉錄反應：在上述反應液中加入 4μl 5×cDNA RT Mix，6μl DEPC-ddH2O,輕輕混勻， 短暫離心；50℃孵育 5-15 分鐘；85℃加熱 3 分鐘使酶失活；置于冰上進行后續實驗或 冷凍保存。 注意：Real-time qPCR 時，作為模板直接稀釋后添加（添加到 PCR 反應液中的反轉錄稀釋液，盡 量不要超過 20%，以免導致 PCR 反應效率低下，無法準確定量）
1. PCR 體系：推薦體系（50 μl）試劑用量模板 DNA10 × Taq PCR Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlTaq DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提 高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。b 鎂離子濃度請以 終濃度 1.5-3mM 作為設定范圍的參考?？筛鶕煌囊飳湍０鍋碚{節鎂離子濃度，由此優化反應體系）2. PCR 程序過程溫度時間預變性94℃5 min變性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec終延伸72℃5 min（注意：a 一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，無法得到理想的擴增效率時， 適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。b 延伸時間應根 據所擴增片段大小設定，Taq DNA Polymerase 的擴增效率為 1 kb/30 sec。c 可根據擴增產物的下 游應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非 特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環次數）3. 結果檢測：反應結束后取 5 μl 反應產物，加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳 檢測。